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精子分析中基于CASA技術的應用指南（二）
三、儀器的基本使用方法
9、當儀器用于精漿中非獲能精子運動分析時，CASA儀器的放大倍數的選擇應遵循讓大多數精子離開視野前跟蹤錄像0.5秒。因此對于人類精子分析，視野范圍不少于200X200 um,這允許被跟蹤精子直線速率平均值可以到達100um/s。
10、對于人類精子分析，物鏡放大倍數是10倍、必須用上合適的孔徑數值和提供足夠聚光深度。
11、在活力分析中，數字化設備應有符合標準視頻技術的最大分辨率。
12、在理想狀況下，人類精子活力分析需要采集圖像的頻率為每秒50幀以上。
13、最少需要跟蹤0.5秒是為了獲取跟蹤軌跡可靠的運動學數據值。CASA的參數值應為了盡可能隨時達到這個目的而設置。如果一份樣本中的數據包括很大比例的短軌跡，那么用戶必須意識到這可能是他們對數據和結果的偏見造成的。如果使用更長的軌跡，必須通過排除快速運動離開視野范圍的精子，通過排除額外快速運動進入視野采集窗口中的精子或者計數個體軌跡的分段作為多個軌跡的精子，且須說明排除后并不影響結果。
四、測定精子濃度
14、這不能成為獲取CASA設備的基本原因。
15、如果用戶希望用CASA儀器測量精子的濃度，那么他必須使預期的測量程序和已經存在且可靠的技術對比分析來提供準確的結果。
16、普遍認為現在這一代CASA儀器對于精子濃度的測量不能提供準確、可重復測量的值，除非能夠通過特殊的染色方法從其他細胞和碎片中分辨出精子來。如定量的DNA熒光染色來測定原子核大小。
五、精子活動率的測量
17、這不能成為獲取CASA設備的基本原因。
18、如果用于精液常規分析中，CASA應當確定逐漸運動精子的濃度。如果在精液樣本的制備、儀器的使用、用戶適當標準的定義中足夠謹慎，CASA就能準確測量這個值。
不能依賴CASA儀器在跟蹤活精子的同時區分細胞碎片和死精子，因此現在的CASA儀器不應用于精子存活率測定。
六、精子運動的測定
19、目前大家一致同意以下觀點：(ⅰ)測量的精液樣本濃度高于CASA儀器制造商推薦的濃度一定要用自身無細胞精漿稀釋；(ⅱ) 所有的CASA分析在體溫環境下進行，人類精子分析在37°C進行；(ⅲ) 一定要使用最小深度為10 um的計數板，深度大于20 um沒有任何好處。(ⅳ) 每份精液樣本至少分析200條活動的精子。
20、研究應承擔發展出精漿中分離出的精子在人工培養基中精子運動學標準化檢測的責任，以達到活動精子的濃度可以調整到CASA設備發揮最佳性能的目的。使用的培養基必須是非獲能的。
21、因為推導非獲能精子平均路徑依賴于圖像采集的幀率和單個精子的幾何軌跡，所以強烈呼吁CASA設備制造商開發允許適當的平滑化處理每個精子運動軌跡的軟件。
22、無論是在精漿中還是在標準試驗培養基中，同一類精子運動學平均數值被認為價值有限。這是因為值通常不是正態分布，使樣本平均值不能準確估計樣本。因此(ⅰ) 中位數、范圍或者百分位數都被認為比平均值更有意義。(ii) 應該做出多參數運動學定義。定義將允許將每個精子按照相關功能分界端點分為不同的種類（例如穿透力強的精子）。
對于臨界值的分析，建議每個軌跡數據值保存在數據庫中。無論從樣本描述或和其他樣本對比時選擇最合適的統計學方法，以便檢查它們的分布情況。
23、強烈呼吁CASA的設備制造商發展更加智能重建軌跡的軟件。特別是矢量跟蹤解決令人困惑的軌跡，例如那些相互碰撞精子產生的軌跡，離開視野/進入視野錯誤結合在一起的復合型軌跡。雖然不可能消除對儀器的依賴，但這將在一定程度上減少檢測濃度時對CASA儀器的依賴。
七、CASA分析超活化精子
24、在識別超活化精子中平均時間運動學數據測量要特別小心。本文建議現代化的研究應專注于無維度的、獨立機器的運動測量模型。
25、精子超活化研究準備液化的精液樣本不應使用對精子功能有潛在危害的技術，例如最初從精漿中分離精子的離心法。
26、應采用一種適當的培養基，即它支持精子體外獲能。然而培養基必須含有至少25 mM 碳酸氫根離子和一定數量的鈣離子，還有葡萄糖。足夠的蛋白質，至少需要10 mg/ml，要包含出現吸附玻璃現象的最小含量。
需要牢記的是含鐵元素的介質在人類精子擴散培養中已被證明能促進形成活性氧（ROS）。
27、所有超活化分析必須在體溫的環境中進行，如人類精子超活化分析在37°C。
28、一定要準備足夠深度的計數板以保證不限制超活化精子的運動。對人類超活化精子分析，最小的計數板深度為30 um是必要的。盡管50 um也許是理想的深度，它只能在所選用光學系統解決這個深度聚焦問題后才能使用。
29、對于超活化運動的定義必須把圖像采集頻率考慮在內，并且使用已經被CASA儀器驗證的運動學分類標準。
30、本文建議應發展與機器無關的精子運動測量標準：(ⅰ) 允許在CASA儀器和實驗室之間更加容易對比分析。(ii) 把正常無超活化的模型和少見大量超活化模型之間的差異考慮在內
八、CASA形態學分析
31、現在這一代的CASA儀器沒有足夠的能力用特定方式分析人類精子形態學來滿足常規臨床應用。特別是，不能評估精子的中段和尾部區域（WHO指南中需要）被認為是主要的缺點。因此，在1992年出版的WHO版本中不支持CASA儀器在臨床中評估人類精子形態。
32、在準備人類精子形態學分析中（包括制作和染色準備）應該發展一個優先使用CASA技術的標準化協議。
九、CASA的臨床應用
33、在男性不育診斷中，要使用CASA首先應對病人進行適當的臨床評估（包括臨床病史和身體檢查）。
34、目前，CASA應用于臨床應首先有根據公認的WHO的指導原則建立的一個精子的基本概述。
35、臨床醫生應明白分析之前正確處理樣本是獲得有用信息的關鍵。這對所有的精液分析都很重要，不僅僅是CASA。因此禁欲時間和射精到檢測時間間隔必須精確記錄。
36、研究是必要的，用目前這一代的CASA系統解釋：(ⅰ) 限制男性正常生育的精液質量；(ii) CASA變量和妊娠時間之間的關系；(ⅲ) CASA變量（尤其是超活化）和IVF結果之間的關系。
WHO5標準特點
十、CASA的生殖毒理學應用
37、在附睪和輸精管的精子毒理學研究中，接受樣本必須被稀釋，其用戶必須解釋: (ⅰ) 稀釋過程不能損傷精子；(ii)在分析過程中培養基用來支持精子持續正常運動；(ⅲ) )精子的濃度已經調整和控制到盡量減少擁擠產生假現象的濃度范圍內。
38、顯微鏡放大倍數根據精子大小和速度來調整（對于比人類精子更大更快的大鼠精子，X4的物鏡是最合適的），并且計數板的深度要允許精子無阻力的運動（計數板的深度大于40 um適合大鼠精子）。
39、用戶必須驗證儀器設置已經優化到能檢測所有運動的精子。
40、用戶必須驗證圖像采集在檢測物種的體溫環境下進行。
41、在制備嚙齒類動物精液樣本時，CASA可以用來確定精子運動百分比和緩慢運動的百分比。用戶定義的閾值應根據控制樣本中臨界端點的分布來調整。
42、推薦使用永久保存樣本的方法，例如視頻或數碼圖片，這樣數據在任何時候都可以重新核查,且當軟件功能升級時有必要重新檢測。視野應采取隨機記錄的方式以防止用戶根據視頻表現來選擇或拒絕特定的視野。
43、新的用戶應把它們的樣本制備方法和得出的速率數據去與符合當前實踐的文獻中達到的最低標準做對比分析。